色谱柱知识点8

一一

色谱柱的死体积V。
在实际的色谱分离过程中，当将一个样品注射进色谱柱后，几乎都可以观察到一个小峰，它将先于所有其他组分而第一个流出色谱柱。通常认为，这是在柱中不保留的成分或杂质的峰，它所需的流动相体积即代表死体积（deadvolume)Vo。
有人曾对典型的反相柱进行了测试，结果显示，在色谱柱中，流动相占柱内总体积约68%，在流动相体积中，粒间隙体积约占2/3，孔内体积约占1/3；在间隙体积中真正能流动的流动相占总间隙体积的2/3左右。因此在柱中的流动相中，总共只有约50%的流动相是流动的，剩下的50%，即孔内的及粒子间隙中接近粒子接触点的流动相，则是相对静止的。由此可见，在色谱柱中的流动相，处于很复杂的状态下，柱子的死体积很难以一种简单的方式去统一地加以处理。

不对称峰的出现意味着溶质谱带在柱床中移动速度的不均匀性。
从色谱图上看，两个溶质的分离，表现为它们的色谱峰能彼此分开且峰形尖锐而对称。
一根柱子的理论塔板数越高，则溶质从柱上流出曲线的方差或峰宽越小，即峰越尖锐，这表明这根柱子对溶质的分离能力高，即柱效高。因此，理论塔板数的大小，可以用来表征柱子柱效的高低。要注意的是，这里计算的n值，只是被测柱的理论塔板值。为便于相互比较，可以引入理论塔板高度的概念。理论塔板高度（height equivalent to one theoretical plate:HETP)系指每一理论塔板所占的柱长


高压匀浆法装柱
最常用的方法是高压匀浆法。将填料悬浮在适宜的匀浆液中制成匀浆，在其尚未沉降之前，很快地以高压泵将其以很高的流速压进柱中，便可制备出填充均匀的柱子。高压匀浆法的设备，如图3-9所示。


应注意不要伤及内壁表面的光洁，尤其不能造成轴向的划痕。将清洁的柱管的一端装配上带滤板的柱头，另一端则连接至匀浆罐上。配制匀浆液是高压匀浆法的重要一环，不同的填料应采用不同的匀浆液。不同的文献和实验室所报道的匀浆液的种类和比例有所不同。例如，填充硅胶正相柱，可以使用1：1的氯仿-甲醇；对于C1a反相填料，可以使用适宜比例的正己烷-氯仿混合溶剂。若有四溴乙烷等高密度溶剂，也可以以20%的高密度溶剂与40%的二氧六环和40%的四氯化碳配成匀浆液。一些实验室中，常以2：1的四氯化碳-二氧六环配成匀浆液，也可以填充出性能很好的柱子。称取所需重量的填料，将其置小烧杯中，按其质量的10倍量（一般也可以按体积计，即10mL的匀浆液中加入1g的填料）加入匀浆液。摇动或搅拌均匀后，将其移至超声波浴中，以中强的超声波令填料粒子均匀而稳定地悬浮起来。最后，再以强超声短时间强化一下。超声处理的时间不宜过长，一般应不超过2～3min，过长则可能造成颗粒的破碎。将准备好的匀浆液立即倒人匀浆罐中，装满后，将匀浆罐盖好、旋紧，再以针筒抽取一定量的匀浆液，从盖子上的连接孔中插入匀浆罐内部并加注匀浆液至从连接孔中溢出为止。这一操作的目的是排除匀浆罐中的空气泡，空气泡的存在会妨碍向系统中迅速地施加压力。抽出注射针并将罐与气动放大泵的出液管路相连。确认连接正确且牢固后，即可开启放大泵的截门，令储存于气动放大泵内的顶替液（正相时可以使用氯仿，反相时可使用甲醇）高速压入罐内。以常见的5μm多孔硅胶填料为例，填装压力为50MPa左右（细孔硅胶可至70MPa）。这里使用的是瞬间升压的方式，也有文献报道使用程序加压。加压时，匀浆液中的填料滞留于柱尾的滤板上而匀浆液则被排除于柱外。开始时，排出的匀浆液因含部分气体，释压后会逸出而使液体浑浊。待全部匀浆液被排出后，因顶替液黏度较少而流速亦稍加大，且排出液有明显的外观上的变化。此时，可以稍稍降低填充压力，例如，降至约35MPa，并维持30～40min，然后，在约30min内逐步将压力降至常压。降至常压后，宜静置一段时间，例如30min，以让柱床内的压力平衡。否则，过早拆卸下已填充的柱子时，会因柱子内部的残余压力而将柱头上的填料挤出柱外。拆下已填装好的柱子并装配上带有筛板（滤网）的柱头（注意：一定要将沾在柱头锥套上的填料除净，否则会影响到柱子的密封性），做好标记，即已完成柱子的填装。
在上述填装程序中应该注意的问题是：①高压操作的安全问题。常发生的问题是柱子与匀浆罐连接不牢，造成加压时柱头被高压冲下或柱子从匀浆罐上滑脱。此时，轻则填装失败，材料损失，重则造成人身伤害事故，一定要加以防范。除每次填装前均须仔细确认是否连接正确且牢靠外，最好还可加上由法兰盘和长螺杆组成的预防脱落装置，以防万一。②通常，先填装的柱床较后填装的柱床紧密。因此，当使用时宜以相反的方向为宜，即让近匀浆罐一端作为使用时流动相的出口，而填装时的出口端则作为流动相的入口。③新柱子使用前应以甲醇冲洗20～30min后，再改用流动相平衡。④新柱子宜选适宜的标准样品进行评价并记录，以备存查和比较。实验和理论研究均指出，以上述下流式匀浆法难以填装成长柱子，其原因是，随着已填充柱床的增高，对流体的阻力亦逐渐增加，使在一定压力下通过柱床的流速降低，亦即柱床的增长速度变慢，在这一过程中，填料颗粒的沉降亦在进行，导致所填充柱床的紧密性和均匀性降低。为保证达到一定柱效，一次填充的单柱长度不宜过大。有文献指出，使用6mm内径的柱子，5um粒径填料，适宜的单柱柱长为10~15cm。但是近年来，44.6mm×250mm的预装柱已被认为是标准柱型，在这样的柱子上，多能获得≥80000块/m理论塔板