色谱柱知识点7

一一

柱效(N)、选择性(ɑ)、保留因子(K)，是色谱填料研发的关键点所在;也是使用者挑选、使用中必须高度重视的三个根本性的问题。

据统计，硅质填料在色谱分析填料家族的应用方面占80%左右。硅胶除了具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面外，一个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面化学键合和改性的基础, 因此硅胶填料装填的色谱柱柱效高,分辨率高,可用于高效液相色谱分离。早期的硅胶是无定型的二氧化硅颗粒(图2)，主要是通过碾磨块状硅胶, 然后通过筛分制备而成。这种色谱填料装成的柱子柱效低，稳定性和重复性，适用于较粗分析和分离。HPLC技术取得极大的进步是得益于球形硅胶的出现(图3), 尤其是小粒径的球形硅胶(粒径<10微米)的出现(图4)，极大地改善了色谱填料的性能, 大幅度增大高效色谱的分离和分析能力, 才使得HPLC成为生化、医学、药物临床、化学化工、食品、卫生、环保检测和商检等领域不可缺少的检测和分离手段。



国外大规模生产硅胶色谱填料的主要厂家是瑞典的Kromasil、日本大曹(Daisol)和富士公司 (Fuji)。
我国月旭科技(上海)股份有限公司正在大力发展色谱柱和色谱填料研究和生产，年销售各种色谱柱达到4万根以上。月旭科技2005年开始从事色谱相关的业务，14年来在色谱领域坚持自主研发和自主生产自己的品牌，先后推出了包括Ultimate®、Xtimate®、Welchrom®、Topsil®和Boltimate®等多个品牌的色谱柱及色谱填料产品，为广大客户提供色谱分离分析技术、产品和整体解决方案。 　　特别值得一提的是,月旭科技打破进口品牌的壁垒，在色谱填料的研发和色谱分离分析方法开发已经达到国内领先、国际先进的水平。据悉，目前月旭开发的色谱柱填料超过百余种，在医药、食品和环境检测方面的应用超过5000个，并且已经有19款被列入美国USP-PQRI数据库。 　　苏州纳微科技股份有限公司利用独有的专利技术制备出均粒、高纯、全孔硅胶色谱填料(UniSil™系列)，突破了单分散二氧化硅制备技术难题。该填料具有精确的粒径尺寸和高度均匀的粒径分布，是目前色谱技术应用的理想填料之一。纳微科技生产的高质量，高性能，种类齐全的硅胶基质色谱填料(图5)。常规硅胶色谱填料粒径大小分别有2、3、5、8、 10、 15、 20、 30、40、 50μm;常规孔径可选择0.1nm,、0.12nm 、 0.17nm 、 0.3nm 、0.5nm。该填料具有机械强度高、柱效高、分辨率高和反压低等特点，并已广泛应用于有机化合物及中性分子的分析和大规模生产制备。

HPLC方法开发时首先要：了解方法的目的（分析？制备？）了解样品性质（极性？酸碱性？）选择合适的色谱柱
色谱柱和流动相的选择是色谱技术的核心之一
色谱柱的选择是方法开发的一个重要环节
选择合适的色谱柱可以缩短方法开发所需要的时间、并且使开发的方法更稳定
在不合适的色谱柱上进行方法开发通常需要更长的时间、并且成功率较低




柱子是否可以反冲
一直有争论，那什么样的柱子可以反冲，什么不可以。反冲后是正者用，还是反着用。具体到各型号柱子不仅是ODS柱，其他如正向柱、氨基柱、离子交换柱等最好都有解释。
答：一般的正相反相柱应该都能反冲，只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲，不过目前这样的柱子已经比较少见了。反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉，反冲后还是正着用比较好，以免柱子的两头都被污染。我们一直提倡的是：正向使用，反向冲洗。
柱子的活化
对于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护？为什么要这样做？
答：新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。
预柱或保护柱用还是不用的问题！
原来分析中药品种时，我一直都是用保护柱。但来到新公司后，发现大家都没有使用，几个实验室连保护柱都没找到一个，也就是说大家从来都没有用过。后来问一个老员工，说是有可能影响药品分析。我就想问：安装保护柱后会影响样品分析吗？我们做的大多是头孢类的抗生素。
答：应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞，肯定有害于分离度和柱效，因为保护柱中间有着死体积的存在但是如果保护柱接得好，并且尽量控制其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。
头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽，有些原料药，可以根据色谱柱的损耗选择添加预柱（中间是个筛板），制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大，那还是最好配个保护柱。
填料方法
前三种都是湿法吗，能不能对四种填充方法做一个简短的说明？
资料显示：在正常条件下，填料粒度＞20µm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20µm时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。为什么以20um为分界点？
多个样品不好不离的时候，请问该怎么通过选择合适的柱子来提高分离度？
答：提高分离度可从三个主要影响因素来考虑，柱效、选择性和保留因子。可通过减小填料粒径和增加柱长提高柱效；选择性和固定相选择以及pH条件有关，通过选择合适的色谱柱和合适的pH，可以提高选择性；有时候适当延长出峰时间增加保留因子，也可提高分离度。
普通的C18柱能作为正相色谱柱使用吗？正相色谱体系中最常用也最普通的是那种色谱柱。正相柱在使用过程中与反向柱相比有什么需要注意的地方？
答：普通C18柱作为正相柱使用，我还没听说过。正相色谱分离模式是指固定相的极性比流动相的极性大，反过来，流动相极性大就是反相。C18固定相属于疏水性相对比较强的，疏水性强就是极性很弱，应该找不出极性比它更弱的流动相了。
正相体系常见的柱子有：硅胶柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱，最普通的应该就是硅胶柱。正相柱和反相柱比，最需要注意的是水分，正相柱对水分非常敏感，流动相中水分含量的些微变化对保留时间影响很大，因此正相柱测定前平衡时间需要几个小时甚至更长。
相对于气相色谱，液相的优势在哪里？做防腐剂分析时，流动相加入乙酸铵才可以出峰，原理是什么？
答：液相和气相相比的优势有很多,我认为主要在于应用范围更广。气相只限于容易气化的低分子量物质的分析测定，对象大部分是基础化工原材料；而任何能溶解于某溶剂的物质都能用液相分析，适用对象是分子量从几十到几万的广大范围。在制药、化工、环保、食品和刑侦等诸多重要领域，液相都已成为主导的分析分离工具。也有两者都能应用的交叉情况，但液相的制样更简单。液相色谱的出现克服了气相色谱不能直接用于难挥发、热不稳定及高分子化合物的弱点。
今天才知道滤膜的材质分了这么几种：再生纤维素、聚四氟乙烯、硝酸纤维和醋酸纤维等，之前只知道有有机系和水系之分？各种不同材质的滤膜适合于什么样的样品？
答：再生纤维素膜：具有蛋白质吸收低，适用于水溶性样品和有机溶剂；
聚四氟乙烯：适用于所有有机溶剂，酸和盐；
尼龙66：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%的乙醇，二氯甲烷，不适用与二甲基甲酰胺；
醋酸纤维：不适用有机溶剂，特别适用水基溶液。
保护柱和预柱的作用是不是一样的，如果不一样有什么区别么？保留时间漂移多少为可以接受的范围？
答：保护柱一般带填料，相当于一根缩短了的色谱柱（一般是1-2cm长度），卡套里可更换的柱芯，柱管、筛板和填料都有。保护柱里的柱芯好像是在前面开路的扫雷部队，流动相和样品里如有什么损害柱子的污染物，保护柱就自己承受了下来。
而预柱，现在一般指的就是接在进样器和色谱柱之前的在线过滤器。在线过滤器和保护柱的最大区别是不带填料，只有可更换的筛板。预柱只能保护色谱柱免受颗粒物质的污染，而不能阻挡溶解在流动相中的强保留物质。


C8和C18的区别
他们都是色谱填料的一种，C8代表该化合物由8个碳组成，c18同理（表示其固定相是，键合到硅胶上的烷烃是18个碳的）。色谱柱填料的特点是标志色谱柱的重要方面，你常常会看到在C8或C18的前面，有些其他的名称，比如hypersi1之类的，他们表示在C8或C18的基础上，进行了一些该进，因此更适合于某类特定化合物的分析。从表面上看，C18和C8的区别就是C18比C8少了10个碳原子，而我们要讨论的区别，就是差别这十个碳原子带来的。其实谈到色谱，必须要搞清楚的一个就是极性，因为色谱分离的一个重要原理就是“相似相容”。那我们就先谈谈极性。
C8和C18都是反相色谱柱的一种，适用于分析弱极性的物质，而C8在弱极性较强的一侧，C18在极性较弱的一侧。也就是说，C8适合分析弱极性物质里极性稍强的一类物质，C18适合分析弱极性物质里极性更弱的物质。这是他们极性上的差别，但是差别并不是特别明显，一般能用C8分析的物质，在C18上也能分离。这是因为，后者比前者的保留特性更好一些，这似乎和色谱柱填料的结构关系更为密切。
在让我们谈谈空间位阻的问题，也许由于C18比C8的碳链更长，因此带来更好的保留特性。因此C8就更适合分析大分子类的物质，比如一些球蛋白等，都用C8和缓冲盐洗脱剂来配合使用。相反，分子量较小的物质，经常用C18来进行分析和分离。
另外，你还会经常在C18前面看到“ODS”的字样，ODS是英文octadecy1 silane的所写，意思是十八（烷）基硅烷，是以硅胶为基质键合的C18填料，由于大部分的C18柱都是硅胶基质，因此有时你还会看到色谱柱上只标称二者之一。其中以ODS居多。有时你还会看到ODS-x，x是不同的数字，这个x虽然是数字，但是不同厂家的产品代表的含义不同，一般以含碳量区分，但这也不是绝对的。有时还可能看到RP-18或RP-8，RP-18和C18意义基本一致，但是不同的厂家有不同的规定。
C8和C18虽然有这些差别，但是使用和维护的办法都是一样的。采用反相色谱柱的维护办法就可以了。

纸色谱法(paper chromatography)
纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位重以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位重及大小进行定性和定量分析。
薄层色谱法(thin-layer chromatography,TLC)
薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的法操作以达到分离目的。





色谱仪的色谱保留值是样品组分在色谱仪中的保留行为，反映组分与固定相作用力的大小，描述组分色谱峰在色谱图中的位置。保留值是总称，具体参数如下：

一、死时间：

指不被固定相吸附或溶解的组分进入色谱柱时，从进样到柱后出现色谱峰极值时所需的时间。

二、死体积：

指色谱柱填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路与连接头之间的空间及检测器的空间的总和。当后两项很小，可忽略不计时，死体积可用死时间与流动相体积流速的乘积来计算。

三、保留时间：

指从进样开始到柱后出现色谱峰极大值时所需要的时间。

四、保留体积：

指从进样开始到柱后出现色谱峰极大值时所通过的流动相体积。

五、调整保留时间：

指某组分的保留时间扣除死时间后的时间。

六、调整保留体积：

指某组分的保留体积扣除死体积后的体积。

七、相对保留值：

在相同的色谱条件下，被测样品和标准样品的调整保留值之比。