色谱柱知识点3

一一

缩略词
表面多孔粒子 （superficically porous particle,SPP） 或称核-壳粒子(core-shellparticle)
亲水作用色谱(hydrophilic interaction liquidchromatography,HILIC)
超高压液相色谱(ultra high pressureliquid chromatography，UHPLC）系统
阳离子交换色谱和反相液相色谱（CEC-RPLC）
PEEK（即聚醚醚酮）和聚四氟乙烯管
吸附色谱(adsorption chromatography)
分配色谱（partition chromatography)
正相色谱(normal phase chromatography)；若固定相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相色谱(reversed phase chromatography)
离子色谱(ion chromatography)
体积排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)
亲和色谱（affinity chromatography)
非多孔粒子（nonporous particles,NPP）；全多孔粒子(total porous particles,TPP)；表面多孔粒子(superficially porous particles,SPP)；双重孔径粒子（bimodal porous particles,BPP)和庞大多孔粒子(giga-porousparticles, GPP)
粒径分布(particle size distribution,PSD)
双重孔径硅胶粒子（bimodal poroussilica particles)
庞大多孔硅胶粒子(giga-porous silica particles)
凝胶渗透色谱或体积排阻色谱（GPC）
疏水性相互作用色谱（HIC)

极性固定相
在液固色谱使用的极性固定相，除硅胶外，还有Al2O3、ZrO2、TiO2、MgO等，其中Al203由于具有较好的导热能力，今后，在亚-2um粒子的制作中，会扩展它的应用在极性吸附剂中，硅胶和硅酸镁为酸性吸附剂（表面pH=5），氧化铝、二氧化锆、二氧化钛和氧化镁为碱性吸附剂（表面pH=10～12）。如用酸性吸附剂分离碱性物质（如胺类），或用碱性吸附剂分离酸性物质（如羧酸、酚类），就可能造成色谱峰的严重拖尾或不可逆的保留，为克服此现象，可向流动相中加入改性剂。用硅胶分离碱性样品时，若向流动相中加入少许碱性物质（如三乙胺），就可减轻色谱峰的拖尾或永久性吸附。
非极性固定相
在HPLC中使用的非极性吸附剂为高聚物微球、聚合物包覆固定相和石墨化炭黑。
（1）高聚物微球
高聚物微球主要是由苯乙烯和二乙烯基苯以高交联度共聚制备的全多孔单分散微球，Ugelstad等用种子溶胀聚合法制备的7～20um全多孔分散微球，后由Phamacia公司发展成MonoBeads系列和SOURCE系列，此外Hitachi（日立）凝胶3011、Yanoco（柳本）Gel-5510、Waters公司u-Styragel皆为相近的品。近年还生产了1~3um的非多孔单分散微球，已用于以超热水作流动相的HPLC分析和超高压填充毛细管液相色谱分析中。
高聚物微球的另一类产品称作流通粒子(flow-through particle),它是由AfeyatRegnier 等研制的灌注色谱(perfusion chromatography)固定相，是为生物大分子分离、纯化而专门设计的，其也是苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，粒径为10um、20um、50um，也可作为制备液相色谱固定相。此固定相颗粒内部的孔具有两种不同尺寸的孔径，一种是大孔，称作流通孔，孔径400~800nm；另一种是小孔，称作扩散孔，孔径30～100nm。小的扩散孔把大的流通孔连接在一起，如图3-12所示。这些孔道允许流动相直接进入颗粒内部并能贯穿通过颗粒。这相当于流通孔把一粒填料分割成许多细小的粒子，当溶质分子进入流通粒子时，同时存在扩散传质和对流传质，从而降低了传质阻力。流通粒子的多孔结构使其比表面积并未减小，因此样品负载量也未减小；此外，由于流通孔的存在，色谱柱的通透性良好，降低了填充柱的阻力。所以用灌注色谱固定相制备的色谱柱具有高负载量、高柱效，可在低操作压力下以高流速进行分析。应当指出，流通粒子最适用于生物大分子的制备分离，而较少用于小分子的常规分析分离。
（2）聚合物包覆固定相
聚合物包覆固定相是针对无机氧化物基体材料硅胶的缺点而研制出来的。硅胶在pH>8的碱性介质条件下会溶解而不稳定：在其孔隙中大分子难于扩散而降低柱效；硅胶表面的硅醇基具有离子交换作用，会影响分离。为了改善硅胶的不足之处，并将其制成非极性固定相，人们就在硅胶表面包覆聚丁二烯（PBD）、聚苯乙烯（PS）、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物（PS-DVB）、聚乙烯（PE）等聚合物。早期的制备是采用物理包覆法，现多采用将硅胶表面改性后，再用引发剂与单体进行化学键合。还可用化学气相沉积法，将甲苯、己烷、异辛烷等进行高温热裂解，用热解碳沉积在硅胶表面制成非极性固定相。近年还报道使用Al2O3、TiO2、ZrO2等氧化物来制备包覆前述聚合物的固定相。尤其是TiO2和ZrO2在机械强度和在广pH值范围内的稳定性方面要优于硅胶。


A 型硅胶和 B 型硅胶：A 型硅胶金属含量较高，导致硅胶纯度较低，且酸性较强，从而导致色谱峰拖尾和某些化合物回收率很差；B 型硅胶是通过全合成获得的填料，称之为高纯硅胶，可有效地控制金属离子的含量（一般控制在 0.05% 以内），避免活性化合物在色谱柱上与金属离子产生螯合，也降低了硅醇基的活性，有利于避免碱性化合物拖尾。
甲苯、丙基苯、正丁基苯
同为苯系物，三者组成的混合物体系是典型的结构相近、性质相似的化学物质的分离，具有很强的代表性。本实验尝试采用普通色谱柱和环形筛板色谱柱进行了分离的比较。
整体柱
这种柱子不是以微粒型填料填装的，而是在柱子中通过可控制的聚合反应或其他相分离过程直接形成连续、整体型柱床。此外在柱外制备连续柱床后整块装入柱中的方法也应属于此类柱。
反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、辛烷基硅烷键合硅胶（C8）和苯基键合硅胶等。
离子交换色谱（IEC)
离子交换色谱法(lon-exchange chromatography，IEC)一般以离子交换树脂为固定相，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，当流动相带着分析物中组分生成的离子通过离子交换树脂时，组分离子与可交换的活性中心（离子基团）发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配，固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。按表面基团的不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂表面上含有与分析物中阳离子发生交换的基团，又可以分为强酸性树脂和弱酸性树脂。阴离子交换树脂表面上含有与样品中阴离子交换的基团，也可分为强碱性树脂和弱碱性树脂。
IEC的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂（如甲醇或乙醇）与水缓冲溶液混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶解度。被分离组分在离子交换柱中的保留时间不但与组分离子和树脂上的离子交换基团作用强弱密切相关，而且受流动相的pH和离子强度影响。pH可以改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。
IEC主要是用来分离离子或可离解的化合物，不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于氨基酸、核酸、蛋白质等生物分子的分离。
正相色谱
正相高效液相色谱(normal phase liquid chromatography,NPLC)与RPLC相类似,一般使用的键合固定相的极性大于流动相的极性，在所有HPLC分离应用中，NPLC约占了20%，在实际应用中具有不可替代的作用。在NPLC中常常采用极性固定相，如聚乙二醇、氨基与氰基键合固定相，流动相为相对非极性的烷烃类疏水性溶剂，如正己烷和环己烷等，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等调节组分的保留时间。NPLC适用于分离中等极性和极性较强的化合物，如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等。
用硅胶填充剂或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等，在使用正相体系时，一般都采用弱极性的溶剂作为流动相。此类极性固定相如硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等也可使用含水的流动相，此时化合物的保留随着流动相中水的比例增加而减弱，这种分离模式称为亲水作用液相色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）
氨基柱（-NH2）氨基柱可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。
氰基柱（-CN）氰基柱可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。
亲水作用色谱
亲水作用色谱（hydrophilic interaction chromatography,HILIC）。HILIC已被广泛应用到蛋白质组学、糖组学、环境科学和食品分析等研究领域。HILIC 是近年来逐渐被认可的一种强极性化合物分离方法，它是基于极性化合物在色谱固定相表面水层和流动相之间进行的亲水分配作用达到保留的一种分离模式。在 HILIC 分离中，流动相中水的比例越小，则洗脱能力越弱；反之，洗脱能力越强。化合物的极性越小，则保留越弱；反之，则保留越强。HILIC 模式可以跟任何检测器兼容，并能提高质谱的灵敏度，避免使用离子对试剂，避免进行衍生化，是极性化合物分析最有潜力的分离模式。HILIC 模式一般采用高纯硅胶、硅胶表面键合二醇基、酰胺、两性离子基团等基团或极性聚合物等为固定相，而采用高比例的有机相为流动相。
HILIC一般同正相色谱柱。